【理论前沿】TLR3激动剂体外促进NK细胞抗肿瘤效应的实验研究
廖春香1，2，安媛媛1，2，车启元1，2，陈亮3，龙世棋2，王念雪1，2，杨薇4，赵星1，2
（1.贵州医科大学 组织工程与干细胞实验中心，贵州 贵阳 550004；2. 贵州医科大学 免疫学教研室，贵州 贵阳 550004；3.安顺市人民医院 胸甲乳外科，贵州 安顺 561000；4.贵州医科大学 肿瘤学教研室，贵州 贵阳 550004）
[摘 要]目的：探讨TLR3激动剂 Poly（I:C）转染对体外扩增的人自然杀伤（NK）细胞抗肿瘤活性的影响及可能机制。方法：将体外扩增的人NK细胞分为Poly-NKelect.组[人NK细胞经电穿孔转染Poly（I:C）]、Poly-NK组[脂质体介导的Poly（I:C）并转染人NK细胞]以及NK组（单独NK细胞），采用CCK-8法检查3组细胞对人结直肠癌细胞株DLD-1细胞的杀伤率；根据实验结果选择Poly-NK组细胞进行后续实验，Poly-NK组细胞经TLR3/dsRNA复合物抑制剂处理（Poly-NKinhib.组）及TLR3下游的TBK1/IKKε复合物抑制剂BX795处理（Poly-NK+BX组），采用CCK-8法检测这两组细胞对DLD-1细胞的杀伤率，流式细胞仪检测这两组NK细胞活化标志物CD69的表达，ELISA检测干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及穿孔素（perforin）的表达水平。结果：与NK组比较，Poly-NKelect.组和Poly-NK组对DLD-1细胞的杀伤率增加；与Poly-NKelect.组比较，Poly-NK组对DLD-1细胞的杀伤率更高，因此后续试验均采用Poly-NK组进行比较；与Poly-NK组比较，Poly-NK+BX组对DLD-1细胞的杀伤率降低、CD69表达降低、perforin及IFN-γ表达降低；与Poly-NK组相比，Poly-NKinhib.组对DLD-1细胞的杀伤率降低、CD69的表达下降、TNF-α及IFN-γ的表达降低。结论：Poly（I:C）可促进人NK细胞的体外抗肿瘤活性，TBK1/IKKε激酶复合体可能参与了Poly（I:C）对人NK细胞的活化。
自然杀伤细胞（natural killer，NK）是机体固有免疫的组成细胞之一，主要分布于外周血和脾脏。在正常情况下，NK细胞通过识别细胞表面的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）Ⅰ类分子区分“自我”与“非我”以杀伤或诱导凋亡来清除肿瘤细胞或病毒感染细胞。活化的NK细胞可以通过分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、穿孔素（perforin）、趋化因子等调节机体的抗肿瘤免疫应答。IFN-γ可通过促进Th1应答、抑制病毒复制、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞表达主要组织相容性复合体-Ⅰ类分子（major histicompatibility complex，MHC-Ⅰ）等发挥重要的抗肿瘤作用；NK细胞释放的perforin是一种具有成孔作用的溶细胞蛋白，在NK细胞脱颗粒时，perforin可以结合到靶细胞的质膜上，并以钙离子依赖的方式聚集，在靶细胞上形成孔并允许颗粒酶扩散到靶细胞中，使靶细胞发生裂解，perforin被认为是T细胞和NK细胞介导的溶细胞作用的关键效应分子。目前，NK细胞已被广泛用于肿瘤的过继免疫治疗中。由于NK细胞仅占外周血淋巴细胞的5%~15%，因而可以通过体外扩增以满足临床治疗的需求。实验研究已表明，体外扩增的NK细胞在肝癌、胶质母细胞瘤、白血病等多种肿瘤中均表现出良好的抗肿瘤效应。本研究探讨TLR3激动剂 Poly（I:C）转染对体外扩增的人NK细胞抗肿瘤活性的影响及可能机制，报道如下。
1、材料与方法
1.1细胞株及试剂
1.1.1 细胞（株） 人结直肠癌细胞株DLD-1细胞购自中国典型培养物保藏中心（China center for type culture collection, CCT- CC），人NK细胞根据本课题组前期已建立的方案进行体外扩增并冻存备用。
1.1.2 主要试剂 RPMI 1640、MEM、Opti- MEM减血清培养基及青霉素、链霉素、胎牛血清（FBS）均购自Gibco公司，高分子量Poly（I:C，HMW）购自美国InvivoGen公司，Lipo3000购自赛默飞公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，流式检测所用的抗人FITC-CD69抗体、抗人PE-CD56抗体及相关试剂购自BioLegend公司，人perforin及人TNF-α的ELISA检测试剂盒均购自美国Abcam公司，人IFN-γ的ELISA检测试剂盒购自BD公司，TLR3/dsRNA complex inhibitor购自德国Merck公司，TBK1/ IKKε抑制剂BX795购于Abcam公司，DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ）购自 Solarbio公司。
1.2方法
1.2.1 Poly-NKelect.组及Poly-NK组细胞对DLD-1细胞的杀伤率 液氮罐中复苏一支人NK细胞，细胞量约为2×108个，复苏后加入完全培养基100 mL将细胞浓度调整为2×106个/mL，在37 ℃，5%CO2培养箱中放置2 h备用。Poly-NKelect.组细胞是将5×106个NK细胞用250 L减血清Opti-MEM培养基重悬后转移至电转杯内（避免产生气泡），放入Celetric电转仪中，电转条件为380 mV、30 ms，电转结束后加入完全培养基调整细胞浓度为2×106个/mL，置于温箱中备用（Poly-NKelect.组）。在1.5 mL离心管中加入培养基500 L，再加入脂质体2 L，再加入等体积Poly（I:C），充分混匀后室温静置30 min后与浓度为2×106个/mL的NK细胞共孵育过夜（Poly-NK组），Poly（I:C）终浓度为10 mg/L，设置单独NK细胞作为对照组（NK组）。次日将三组细胞轻轻混匀，准备3支15mL离心管并标记，用200目细胞过滤网过滤后于离心机中950rpm，离心10min，台盼蓝染色计算细胞存活率后将细胞浓度调整为3×106个/mL备用。以DLD-1细胞为靶细胞，Poly-NKelect.细胞、Poly-NK及单独NK细胞作为效应细胞，先在96孔U型反应板中加入浓度为6×105个/mL的DLD-1细胞，100 L/孔，于操作台中静置约5min，按照5:1的效靶比加入浓度为3×106个/mL 的3中不同处理方式的NK细胞，100 L/孔，用培养基补至终体积为200 L，每组3个复孔，同时设置单独培养基为空白对照组，置于温箱内作用5 h后加入20 L/孔的CCK-8溶液，置于细胞培养箱内反应2.5 h后，用酶标仪检测各孔光密度（optical density ，OD）值，NK细胞杀伤效应用死亡率（%）表示，细胞死亡率（%）=[1-（效靶细胞孔OD值-效应细胞孔OD值）/靶细胞孔OD值]×100%。
1.2.2 Poly-NK组及Poly-NK+BX组细胞对DLD-1细胞的杀伤 根据实验1.2.1选择Poly-NK进行后续实验。根据文献查阅及前期实验摸索，选择BX795抑制剂的浓度为10 mol/L。为验证在BX795的推荐浓度下DMSO对实验的安全性，设置了相同体积的DMSO作为溶剂对照组（NK+DMSO组），将抑制剂先加入单独的NK细胞中孵育30 min，再加入Poly（I:C）置于37 ℃含5% CO2的温箱中孵育过夜。次日接板及计算方法同1.2.1。
1.2.3 Poly-NK及Poly-NK+BX细胞的表面活化标志物CD69的表达 调整Poly-NK及Poly-NK+BX组细胞浓度为1×106个/mL，设单独NK细胞组作为对照，按每管1 mL分装到1.5 mL离心管内，离心去上清后用PBS重悬，每管加入Fc封闭液5 L ，室温封闭20 min后加入抗人FITC-CD69、抗人PE-CD56流式抗体3 L，25 ℃下避光孵育30 min，离心，用1×PBS清洗2遍，200目细胞筛过滤，用贝克曼FC500流式细胞仪进行检测，用Flowjo VX软件进行分析。
1.2.4 Poly-NK组、Poly-NK+BX、Poly-NKinhib.组细胞perforin、IFN-γ以及TNF-α的分泌水平 将perforin、IFN-γ、TNF-α的ELISA试剂盒提前30 min恢复至室温，按说明书配制洗涤液、抗体稀释液、标准品稀释液等，将收集的NK细胞对照组、Poly-NK组、Poly-NK+BX、Poly-NKinhib.组细胞培养上清液1 500 r/min，离心10 min，每孔加入100μL上清液，每组设3个复孔和3个标准品孔，按照说明书进行操作，最后用酶标仪检测标准品的OD值，并根据标准品的浓度与OD值关系作出拟合曲线，根据回归方程计算出各组样本中perforin、IFN-γ及TNF-α的浓度。
2结果
2.1 Poly-NKelect.和Poly-NK组细胞对DLD-1细胞的杀伤率
Poly-NKelect.及Poly-NK组细胞的存活率比较，差异无统计学意义。与Poly-NKelect.组比较，Poly-NK组细胞对DLD-1细胞的杀伤率更高，因此后续Poly（I:C）活化NK细胞的实验中均采用Poly-NK组进行实验。
2.2 Poly-NK和Poly-NK+BX组对DLD-1细胞杀伤率
与Poly-NK组比较，Poly-NK+BX组对DLD-1细胞的杀伤率降低，差异具有统计学意义；与NK组比较，，NK+DMSO组细胞存活率无明显变化，差异无统计学意义。提示TBK1/IKKε抑制剂能降低Poly（I:C）转染人NK细胞的抗肿瘤活性。
2.3 Poly-NK和Poly-NK+BX组NK细胞表面CD69的表达
与NK组比较，Poly-NK组CD69表达上升，且平均荧光强度增强；与Poly-NK组相比，Poly-NK+BX组CD69的表达降低，且平均荧光强度减弱。提示TBK1/IKKε抑制剂BX795能降低Poly（I:C）转染的NK细胞CD69的表达。
2.4 Poly-NK组及Poly-NK+BX组细胞perforin及IFN-γ的表达
与NK组比较，Poly-NK组perforin和IFN-γ表达增加；与Poly-NK组比较，Poly-NK+BX组perforin、IFN-γ表达降低。提示Poly（I:C）活化的NK细胞抗肿瘤作用与TBK1/IKKε抑制剂相关。
2.5 Poly-NK组及Poly-NKinhib.组细胞中TNF-α及IFN-γ的表达
与NK组比较，Poly-NK组TNF-α、IFN-γ表达增加；与Poly-NK组比较，Poly-NKinhib.组TNF-α、IFN-γ表达降低，提示Poly（I:C）活化的NK细胞抗肿瘤作用与TLR3/dsRNA复合物抑制剂相关。
3 讨论
模式识别受体（Pattern-recognition recap- tors， PRRs）是机体识别病原体相关分子模式 (Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或损伤相关分子模式（damage associated molecular pattern， DAMPS）的一类受体，可识别dsRNA的PRRs包括黑色素瘤分化相关基因-5 (melanoma different- tiation-associated gene-5 ，MDA-5)、视黄酸诱导基因-1 (retinoic-acid inducible gene-1,RIG-1)以及Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）等。TLR3作为一种可以识别病毒dsRNA的受体，在识别病毒dsRNA后可引起Ⅰ型干扰素（type I interferon ，IFN-Ⅰ）的分泌，诱导干扰素调节因子-3(Interferon regulatory factor-3，IRF-3)和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)转录因子的激活，TANK结合激酶-1 (TANK binding kinase 1,TBK1)及NF-κB抑制蛋白激酶-ɛ（nuclear factor kappa B inhibits protein kinase，IKKɛ）作为TLR3信号通路下游的信号分子，在dsRNA激活 TLR3通路后被活化并参与IFN的产生，诱导机体的抗病毒、抗肿瘤免疫。有研究发现，TLR3的激活可抑制黑色素瘤荷瘤鼠的肿瘤肺转移，抑制膀胱癌荷瘤鼠的肿瘤生长。dsRNA类似物聚肌胞苷Poly（I:C）是一种人工合成的TLR3激动剂，被认为是TLR3的配体而被TLR3识别，可以活化树突状细胞，现已作为治疗性疫苗佐剂用于黑色素瘤和乳腺癌的治疗进入了Ⅱ期临床试验。
在此次研究中，探讨了Poly（I:C）对NK细胞的活化作用及可能的机制。结果显示，TLR3激动剂Poly（I:C）转染人NK细胞后促进了NK细胞的细胞毒作用，在抗肿瘤活性增强的同时伴随IFN-γ、perforin及TNF-α分泌增加、NK细胞活化标志物CD69的上调。而在TLR3/dsRNA复合物抑制剂或TBK1/ IKKε抑制剂BX795的作用下，NK细胞抗肿瘤活性降低，IFN-γ、perforin及TNF-α分泌减少，NK细胞活化标志物CD69表达下调，即Poly（I:C）以TLR3及TBK1/IKKε依赖的方式促进NK细胞的杀伤能力并促进分泌perforin、IFN-γ及TNF-α。以上结果提示Poly（I:C）活化的NK细胞抗肿瘤作用可能与TLR3信号通路的活化有关。本研究虽然证实TLR3通路在NK细胞抗肿瘤中发挥重要的作用，但NK细胞还可以通过MDA-5和RIG-1等PRRs来识别dsRNA发挥抗肿瘤效应，因而还需深入探讨Poly（I:C）促进NK的抗肿瘤活性的相关机制，从而为探索在肿瘤的免疫治疗中如何通过Poly（I:C）等PRRs激动剂来增强NK细胞抗肿瘤活性奠定理论及实验基础。
